Glândula Pineal e Melatonina

Regina Pekelman Markus

Solange Castro Afeche

Eduardo Mortari Barbosa Jr.

Celina Monteiro da Cruz Lotufo

Zulma da Silva Ferreira

José Cipolla-Neto

 

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"The range of periodicities affected by melatonin has yet to be fully defined, but certainly it acts as an internal clock for the timing of daily events. Is has been referred to as the 'darkness hormone' (it is made at night), as 'time in a bottle' and as 'circadian glue' as it appears to hold together, or synchronize, circadian or daily rhythms."

Arendt J.,1995. In Melatonin and the Mammalian Pineal Gland, Chapman & Hall, London, pp. 4.

 

Este capítulo tem por objetivo discutir o papel da glândula pineal e do hormônio melatonina na organização rítmica dos vertebrados. Os mecanismos mecanismos envolvidos com o controle da produção diária de melatonina são apresentados considerando-se as estruturas e vias neurais, os processos de neurotransmissão e neuromodulação e as vias de transdução de sinal na pineal. Também são mencionados os locais onde há uma produção parácrina de melatonina. A seguir são descritos os mecanismos de ação deste hormônio e seus efeitos fisiológicos. Por fim são aboradadas algumas aplicações clínicas em estudo, o uso terapêutico de melatonina e seus possíveis efeitos colaterais.

 

1. História filogenética da glândula pineal e papel da melatonina na organização rítmica dos vertebrados

Presente em todos os vertebrados, e tendo a mesma origem embriológica que os olhos laterais, a glândula pineal de peixes, anfíbios, répteis e algumas aves (passariformes) é diretamente fotossenssível, sendo os pinealócitos estruturas semelhantes aos fotorreceptores da retina de mamíferos. Nessas mesmas classes, além de suas características de fotosensibilidade e de secreção endócrina, a glândula pineal mantém conexões, tanto aferentes quanto eferentes, com o sistema nervoso central através do pedúnculo pineal. Em mamíferos, no entanto, apesar de manter seu caráter endócrino, os pinealócitos perdem sua capacidade fotorreceptiva e a pineal, apesar de manter-se conectada diretamente com o sistema nervoso central, passa a estar sob o comando do ciclo de iluminação ambiental, de forma indireta, através de projeções da retina para estruturas diencefálicas que através de projeções diretas (poucas) ou indiretas, via sistema nervoso autônomo simpático, atingem a glândula pineal (Vollrath, 1981).

Comum a todos os vertebrados, portanto, é o caráter de órgão endócrino, cuja produção hormonal é controlada pelo ciclo de iluminação ambiental característico do dia e da noite. Esse controle é tal que, qualquer que seja a espécie considerada (seja de atividade diurna, noturna ou crepuscular), a produção de melatonina é exclusivamente noturna e a magnitude e duração de sua concentração no meio extracelular está na estrita dependência da duração do período de escuro (escotoperíodo) da alternância dia-noite. Como corolário dessa sua flutuação diária, a melatonina circulante tem, também, seu perfil plasmático variável de acordo com as noites mais longas ou mais curtas típicas das diversas estações do ano.

2. Papel funcional da melatonina na regulação da ritmicidade biológica

Essas características de produção e secreção de melatonina determinam, portanto, o papel fisiológico da glândula pineal: sinalizar para o meio interno, pela alternância entre a presença (ou maior concentração) e ausência (ou menor concentração) diária (amplitude da curva circadiana) de seu principal hormônio (melatonina) na circulação e nos diversos líquidos corpóreos, se é noite ou dia no meio exterior e, ainda, através das características do seu perfil plasmático noturno (duração do episódio secretório de melatonina), qual é a estação do ano.

Dessa forma, a glândula pineal, associadamente aos núcleos supraquiasmáticos hipotalâmicos, constitue parte importante do sistema neuro-endócrino responsável, em última instância, pela organização temporal dos diversos eventos fisiológicos e comportamentais, necessidade fundamental para a adaptação do indivíduo e da espécie às flutuações temporais cíclicas (previsíveis, portanto) do meio ambiente.

Além disso, a produção de melatonina varia de forma importante ao longo dos diversos momentos do desenvolvimento ontogenético, sendo, na especie humana, máxima nos primeiros anos de vida, caindo imediatamente precedendo a puberdade e tornando-se mínima com a idade avançada. Dessa forma, postula-se para a melatonina, também, um importante papel na determinação das modificações fisiológicas associadas ao ciclo de vida (crescimento, amadurecimento e envelhecimento).

3. Mecanismos fisiológicos celulares responsáveis pela síntese de melatonina pela glândula pineal

A síntese de melatonina em mamíferos, que é deflagrada na fase de escuro, depende necessariamente de uma ativação do sistema nervoso autônomo na sua divisão simpática e a consequente liberação de noradrenalina pelos terminais que inervam a glândula. A noradrenalina, interagindo com os receptores pós-sinápticos dos tipos b 1 e a 1–adrenérgicos presentes nos pinealócitos, desencadeia uma série de eventos bioquímicos intracelulares que levam à síntese de melatonina, através de uma via bioquímica que começa com o triptofano passando por 5-hidroxitriptofano, serotonina, N-acetilserotonina e, finalmente, melatonina (Fig. 1).

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Figura 1 – Esquema representativo da síntese de melatonina pela glândula pineal de mamíferos. No painél da esquerda é mostrado esquema do Sistema Nervoso Central Humano com a via retino-hipotalâmica desenhada em verde. A luz incide sobre a retina, que envia informação para o núcleo supraquiasmático (NSQ). Este projeta-se sobre o núcleo paraventricular (PVN), que através de uma polissináptica projeta-se sobre a coluna intermediolateral da medula espinhal. Fibras pré-ganglionares simpáticas projetam-se sobre o gânglio cervical superior, que, por sua vez projeta-se sobre a pineal. Os neurotransmissores simpáticos (noradrenalina e ATP) participam da síntese de melatonina, cuja via biossíntética é mostrada no painél central. No painél da esquerda estão apresentadas as variações da concentração de vários componentes da via biossintética ao longo do dia (luz acesa às 6h00, e apagada às 18h00).

A melatonina é sintetizada na glândula pineal e na retina. Apesar de ter sido referida síntese de melatonina em outros locais, como por exemplo intestino e células sangüíneas, o estudo da via de síntese, em diferentes espécies foi realizado em pineal e retina. A melatonina plasmática reflete a melatonina sintetizada na pineal, enquanto a melatonina sintetizada na retina tem uma ação local. A síntese de melatonina, tanto na pineal quanto na retina é passível de controle pela luz. No caso de pineais de não mamíferos e retinas a ação é direta e as células que sintetizam melatonina têm propriedades fotorreceptoras (Fálcon, 1999). A glândula pineal de roedores é fotossensível apenas no início da vida. Os principais componentes funcionais de uma via de fototransdução estão presentes em altas concentrações na maioria dos pinealócitos em animais neonatos. O declínio dos elementos de fototransdução com a idade, corresponde ao aparecimento da inervação simpática na pineal. (Blackshaw e Snyder, 1997). A partir da segunda semana de idade a informação sobre a iluminação ambiental é feita através de um circuito neural iniciado na retina. Através do trato retino-hipotalâmico a retina comunica-se com os núcleos supraquiasmáticos que por sua vez conectam-se com a coluna intermediolateral da medula espinhal. A partir desta, a informação fótica chega à pineal de mamíferos através de nervos simpáticos. Dessa forma, a pineal de mamíferos está sob controle dos núcleos supraquiasmáticos e estes têm sua atividade rítmica endógena arrastada pela luz ambiental (Moore, 1996).

 

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 Figura 2 – ATP liberado de terminais que invervam a glândula pineal de ratos participa no controle da síntese de melatonina. Painel da esquerda superior: Sistema para realização do bioensaio nervo-glândula em pineais de ratos. As glândulas são colocadas no centro de cada poço são estimuladas por eletrodos de platina (0,1 mseg voltagem supramáxima). Painel superior direito: Curva frequência- resposta mostrando que a estimulação das pineais produz a liberação de noradrenalina. Painel inferior esquerda: Produção de melatonina por pineais estimuladas com a frequencia de 100 Hz. Notar que há um acúmulo da produção, sendo o máximo aos 20 minutos. Painel inferior direita: Antagonistas de adrenoceptors b (propranolol) ou de receptor purinérgico P2Y (suramina e PPADS) inibem a produção de N-acetilserotonina (NAS) por glândulas pineais mantidas em cultura. (adaptado de Mortani et alli, 2001).

 

A síntese da melatonina inicia-se com a serotonina, que é acetilada a N-acetilserotonina, a qual é O-metilada, resultando na melatonina. As as enzimas responsáveis por estas duas fases são a arilalquilamina N-acetiltransferase (NAT; EC 2.3.1.87) e a hidroxi-indol-O-metiltransferase (HIOMT, EC 2.1.1.4). A enzima NAT apresenta um robusto ritmo diário, atingindo concentrações 100 vezes superiores na fase de escuro, quando comparado à fase de claro. O ritmo da segunda enzima é menos evidente, mas HIOMT participa da regulação sazonal da produção de melatonina (Ribelayga et alli, 2000) . Esta variação diária na enzima NAT faz com que a redução dos níveis de serotonina na fase de escuro seja acompanhada por aumento das concentrações de N-acetilserotonina e melatonina.

Trabalhos iniciados na década de 1970 pelo grupo de Klein mostraram que o ritmo de NAT decorre da atividade neural (Klein et al., 1981). A noradrenalina sendo liberada na fase de escuro estimula adrenoceptores a 1 e b 1 produzindo aumento de cálcio intracelular e AMP cíclico, respectivamente. O aumento de AMP cíclico, atuando através de ativação da quinase A, é o principal mecanismo regulador da síntese de NAT. A atividade e quantidade de enzima é maior no período de escuro do que no período de claro, sendo o fator responsável pelo ritmo diário de melatonina. A fosforilação da proteína que liga elementos responsivos a AMPc (CREB) por quinase A é um passo crítico para a promoção da transcrição do DNA. A fosfo-CREB liga-se ao elemento responsivo a AMPc (CRE) localizado na porção promotora do gene da NAT e do gene que transcreve um fator de transcrição inibitório (ICER). A transcrição da NAT leva à síntese de N-acetilserotonina e melatonina e a proteína ICER resulta na inibição da formação da mensagem para a formação da NAT. A mudança da proporção entre fosfo-CREB e ICER depende da duração da estimulação dos adrenoceptores b e pode ser entendido como um fator de autorestrição da resposta celular (Klein et al., 1997).

O ritmo da mensagem para a síntese da enzima não é observado em todas as espécies. Enquanto o conteúdo de RNA mensageiro para a NAT varia 150 vezes em ratos, 10 vezes em galinha e de aproximadamente 1,5 vezes em carneiros, no homem não há alteração do conteúdo da mensagem para NAT ao longo do dia. Estes dados mostram uma alta variabilidade na forma como o ritmo da atividade da enzima é controlado por diferentes espécies. O controle da quantidade de RNA mensageiro e da própria enzima é função da relação entre a quantidade sintetizada e a quantidade metabolizada. Portanto, a ativação de adrenoceptores b é passo essencial na síntese e ativação da NAT.

A estimulação dos adrenoceptores a 1, através de um mecanismo dependente de cálcio leva a uma potenciação da resposta b -adrenérgica. Recentemente, pudemos demonstrar que a estimulação "in vitro" dos terminais nervosos que chegam à pineal resultam em liberação de ATP (Barbosa et alli, 2000) e ativação de receptores P2Y1 (Ferreira et alli, 1994, 2001)(Figura 3). Através das técnicas de microfisiometria e de medidas de cálcio por métodos fluorimétricos demonstrou-se que a potenciação da produção de melatonina induzida por estimulação de receptores P2Y1 é resultante da ativação da enzima fosfolipase C. e elevação dos níveis intracelulares de cálcio (Ferreira, 2001).Paralelamente, através de mecanismo dependente de cálcio, também ocorre um aumento dos níveis intracelulares de GMP cíclico. Interessante notar que não há correlação entre o aumento deste segundo mensageiro e a síntese de melatonina, sugerindo que a neurotransmissão purinérgica está envolvida em mais de uma via de controle da glândula pineal. De fato, foi observado um aumento da atividade do trocador sódio/hidorgênio, o que implica em uma basificação intracelular.

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Figura 3 - Via de transdução desencadeada pela ativação do receptor P2Y1 na pineal. A ativação da fosfolipase C (PLC) leva à liberação de calcio do retículo endoplasmático (RE) que, por sua vez, potencia a produção de melatonina dependente de AMPc e ativa a troca Na+/H+ levando a um aumento do pH intracelular. Esta última resposta ocorre imediatamente após a estimulação do receptor (resposta imediata). A potenciação da produção de melatonina é uma resposta tardia devido a uma cascata de eventos intermediários (Ferreira, 2001).

Além da inervação autonômica simpática, onde a noradrenalina é neutrotransmissor e ATP neuromodulador, a glândula pineal também recebe inervação autonômica parassimpática. Essas fibras nervosas contêm neuropeptídeo vasoativo intestinal (VIP), peptídeo histidina isoleucina (PHI) e a enzima NO síntase (NOS), responsável pela produção de óxido nítrico. A NOS também está presente nas células endoteliais dos vasos da glândula pineal. Portanto esta inervação nitrérgica pode influenciar tanto o metabolismo da glândula pineal como o fluxo de sangue através da glândula. Fibras contendo substância P, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), somastostatina e vasopressina foram descritas nas fibras do nervo pinealopetal, que se originam no glânglio trigêmio. Estudos imunohistoquímicos demonstraram que há pinealócitos contendo os neuropeptídeos beta-endorfina, leu-encefalina e somatostatina. Em algumas espécies foi visto que os pinealócitos fazem contatos sinápticos com outros pinealócitos, indicando uma regulação parácrina na glândula pineal. No entanto é necessário ressaltar que há variações interespécies quanto à inervação e ao conteúdo peptidérgico das células (Moller 1997).

3.1. Papel do cálcio na síntese de melatonina

O cálcio, além de participar da ativação da PKC e na potenciação da síntese do AMPc, parece também ter um papel importante nos eventos subsequentes à elevação do AMPc intracelular que induzem a síntese de melatonina. Utilizando-se análogos do AMPc, e aumentando-se o cálcio intracelular por várias manobras experimentais, verificou-se que o cálcio tem um papel potenciador da atividade da NAT. Os mecanismos dessa ativação da NAT pelo cálcio não são conhecidos, mas poderiam envolver a fosforilação da proteína CREB, através da ativação de uma quinase dependente de cálcio. Evidências nesse sentido provém de dados demonstrando que agentes despolarizantes, como o KCl e a ouabaína, que aumentam o cálcio intracelular, induzem a fosforilação da CREB nos pinealócitos. Ainda, eventos pós-transcricionais poderiam estar envolvidos, uma vez que estes também parecem ter um papel importante na regulação da NAT. Os eventos pós-transcricionais poderiam envolver os sítios de fosforilação pelas quinases proteicas dependentes de Ca2+, que foram identificados na enzima ou os grupos tiol ou ambos, ou, ainda, a fosforilação de enzimas citosólicas que poderiam regular a síntese, atividade ou estabilidade da NAT.

Da mesma forma que a NAT, as enzimas TPH e HIOMT também parecem ser ativadas pelo cálcio. Foi demonstrado que a enzima TPH cerebral é um substrato para a fosforilação por uma quinase proteica dependente de cálcio e calmodulina. De modo semelhante à TPH cerebral, a enzima na pineal poderia apresentar esse mesmo mecanismo. Com relação à HIOMT, a sua dependência de mecanismos ativadores que se utilizam do cálcio foi demonstrada devido à sua ativação por neurotransmissores que aumentam o cálcio intracelular na glândula pineal, como VIP e NPY.

3.2. Papel da Angiotensina II na regulação da síntese de melatonina

Solange Castro Afeche e colaboradores em associação com Ovidiu Baltatu, do Max-Delbrück-Center de Berlim (Baltatu et al., 2001 em publicação), através de estudos in vivo e in vitro tanto em animais controle quanto animais trangênicos (que não têm o gen para síntese de angiotensinogênio no sistema nervoso central e na glândula pineal), demonstraram pela primeira vez na literatura, que a angiotensina II produzida pelos astrócitos pineais e agindo através de receptores AT1 nos pinealócitos (uma ação parácrina, portanto), é responsável pela potenciação da síntese de melatonina estimulada pela noradrenalina. Essa regulação da síntese de melatonina se dá pelo controle dos processos de transcrição da enzima triptofano hidroxilase.

4. Controle neural da produção de melatonina

4.1. Papel do ciclo claro-escuro e da iluminação noturna na síntese de melatonina

Como vimos, em todos os vertebrados o metabolismo da glândula pineal está sob o controle dos ciclos diário e sazonal de iluminação ambiental. Em mamíferos, a luz agindo através da retina, cumpre o papel clássico de arrastador da ritmicidade circadiana na produção de melatonina, fazendo com que seu pico diário coincida sempre com a noite. Diferentemente, no entanto, do que acontece com outros ritmos endógenos, a luz, incidindo sobre a retina de mamíferos durante o período de escuro da noite circadiana, bloqueia, instantaneamente, a produção de melatonina, fazendo com que sua concentração plasmática caia a níveis basais em poucos minutos, podendo ou não ser retomada, dependendo da duração e do momento da noite em que se dá a foto-estimulação retiniana (Klein, 1985). Esse fenômeno de foto-inibição noturna da produção de melatonina, difere dos fenômenos de regulação rítimica determinado por eventos mascaradores ambientais, uma vez que, nesse caso, a presença de luz, à noite, é determinante da síntese ou não de melatonina.

4.2. O estudo do controle neural antes da década de 1970, década-chave no estabelecimento dos sistemas neurais envolvidos no controle da ritmicidade circadiana.

O controle neural do metabolismo da glândula pineal tomou um enorme impulso a partir de 1960, quando J. Ariëns Kappers (1960), demonstrou, no rato, a importância da inervação simpática, suprida por fibras componentes dos chamados nervos conários, ramos dos carotídeos internos, originárias dos gânglios cervicais superiores. A noradrenalina liberada, agindo via receptores b 1 e a 1B, estimula a síntese de melatonina, ativando a enzima-chave arilaquilamina N-acetiltransferase (NAT).

Foi no começo da década de 70 que David C. Klein, importante pesquisador dos Institutos Nacionais de Saúde, nos Estados Unidos, juntamente com seus colaboradores, demonstraram a especificidade da N-acetiltransferase pineal e seu papel de enzima reguladora do processo de produção diária de melatonina. Até essa época, imaginava-se que a NAT existente na glândula fosse do tipo arilamina inespecífica, como a que está presente em todos os tecidos do organismo. A HIOMT, ao contrário, era de localização quase que exclusiva pineal e, portanto, era considerada como enzima-chave e característica do processo de síntese de melatonina. Dessa forma, todos os trabalhos, daquela época, que procuravam estudar os sistemas neurais envolvidos no controle da glândula pineal, preocupavam-se em estudar a atividade da HIOMT. No entanto, como se sabe hoje, a atividade da HIOMT não reflete, do ponto de vista funcional, nenhum dos dois principais aspectos do metabolismo diário pineal: a flutuação circadiana e a foto-inibição noturna aguda.

Deve-se acrescentar, ainda, que os trabalhos anteriores a 1970, estavam prejudicados, também, pelo fato de não se conhecer, à época, as principais características da ritmicidade circadiana, assim como a presença e localização de um marcapasso circadiano nos núcleos supraquiasmáticos. Da mesma forma, dentro da neuranatomia das vias visuais, não havia sido experimentalmente demonstrada a via que posteriormente veio a ser conhecida como retino-hipotalâmica. Esta, apesar de sugerida por alguns só foi efetivamente demonstrada, tanto funcionalmente quanto por métodos neuroanatômicos modernos, no começo da década de 70.

4.3. Papel dos núcleos supraquiasmáticos hipotalâmicos e da via retino-hipotalâmica no controle da síntese de melatonina

O grande impulso no estudo do controle neural do metabolismo da glândula pineal, baseado em conceitos aceitos até hoje, deu-se com dois trabalhos realizados por David C. Klein e Robert Y. Moore, em 1974 e 1979.

Moore e Klein, em 1974, usando técnicas de lesão cirúrgica e eletrolítica e analisando a atividade da N-acetiltransferase demonstraram:

que a flutuação diária da atividade da NAT era endogenamente gerada, expressando-se em livre-curso, após a lesão de todas as vias ópticas conhecidas;

que a preservação da via retino-hipotalâmica era suficiente para manter a sincronização da ritmicidade da NAT ao ciclo de claro-escuro ambiental;

que a destruição dos núcleos supraquiasmáticos abolia a ritmicidade diária da atividade da NAT;que o comando rítmico exercido pelos núcleos supraquiasmáticos dependia de uma via de projeção posterior para o hipotálamo medial e para o fascículo prosencefálico medial.

Em 1979 (Klein e Moore, 1979), os mesmos autores, valendo-se das mesmas técnicas de lesão, voltaram ao estudo do papel das vias visuais, do núcleo supraquiasmático e de suas vias de projeção, no controle da ritmicidade circadiana da atividade da NAT, introduzindo o estudo de sua reatividade à foto-estimulação noturna de longa duração (30 minutos). Concluiram que a via retino-hipotalâmica é a única via visual reguladora da atividade da NAT (como demonstrado no trabalho anterior) e da atividade da HIOMT (invés da via ótica acessória, como era proposto anteriormente); além de confirmar o papel do núcleo supraquiasmático como gerador endógeno da ritmicidade na atividade da NAT, demonstraram, embora usando técnica de lesão eletrolítica, a importância deste núcleo, juntamente com a via retino-hipotalâmica, tanto na resposta aguda da NAT quanto na resposta crônica da HIOMT, à foto-estimulação.

4.4. Papel do núcleo paraventricular hipotalâmico na síntese de melatonina

Uma mudança qualitativa na compreensão do circuito neural envolvido no controle da produção de melatonina pela glândula pineal, vem com um outro trabalho do grupo de David Klein, em 1983 (Klein et al., 1983). Neste trabalho, os autores, através de estudos de lesão e, analisando a atividade da NAT pineal e da excreção urinária de 6-hidroximelatonina (importante metabólito da melatonina plasmática e que mantém com ela uma relação estequiométrica constante), demonstraram a importância do núcleo paraventricular hipotalâmico na produção rítmica circadiana de melatonina. Mostraram que a lesão bilateral extensa desse núcleo provocava uma reducão de 98% na atividade noturna da NAT e de 90% na produção diária de melatonina.

Paralelamente, dois outros autores, Pickard e Turek (1983), demonstraram, também através de experimentos de lesão, a importância do núcleo paraventricular hipotalâmico na expressão de fenômenos fotoperiódicos sazonais, mediados pela secreção de melatonina. Além disso, na mesma época, Lehman e colaboradores (1984), além de confirmar o papel do núcleo paraventricular hipotalâmico em fenômenos reprodutivos sazonais, acrescentaram uma possível via de projeção do núcleo supraquiasmático para o paraventricular, através da região retroquiasmática.

Com esse conjunto de trabalhos, desenhou-se um circuito neural responsável pelo controle do metabolismo da glândula pineal: retina, via retino-hipotalâmica, núcleo supraquiasmático, núcleo paraventricular hipotalâmico, fascículo prosencefálico medial, medula espinhal torácica alta, gânglio cervical superior, nervos conários e pineal.

Esse trabalho de Lehman e colaboradores (1984), teve, ainda o valor de introduzir hipóteses sobre as possíveis contribuições funcionais relativas do núcleo supraquiasmático e do núcleo paraventricular hipotalâmico no controle da secreção diária de melatonina. Através de experimentos de lesão eletrolítica, demonstraram que a ablação dos núcleos supraquiasmáticos reduzia a produção diária de melatonina a aproximadamente 50% dos valores controles, enquanto que a lesão dos núcleos paraventriculares reduziam-na a 10-15%. Estes dados são relevantes à medida que estabelece que o sistema neural responsável pela produção de melatonina pela glândula pineal origina-se, provavelmente, nos núcleos paraventriculares hipotalâmicos e que os núcleos supraquiasmáticos seriam responsáveis pela distribuição circadiana da atividade do sistema neural acima mencionado, fazendo-o mais ativo à noite e menos ativo de dia.

Uma questão fundamental, no entanto, permanecia: seriam os efeitos obtidos pela lesão no núcleo paraventricular ocasionados pela lesão do núcleo propriamente dito ou pela lesão de eventuais fibras de passagem de uma possível via de projeção direta do núcleo supraquiasmático para outras estruturas que se conectariam com os neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna intermediolateral torácica?

A efetiva participação dos neurônios do núcleo paraventricular hipotalâmico no sistema neural regulador da secreção de melatonina pela glândula pineal foi demonstrada, pelo grupo de Michel Hastings, de Cambridge, Inglaterra, em trabalhos que utilizaram a metodologia de lesão por uso de neurotoxinas (Hastings e Herbert, 1986). Esse tipo de lesão atinge quase que exclusivamente corpos celulares preservando, portanto, axônios de outras estruturas que atravessem a região alvo. Nesses trabalhos, usando NMDA ou ácido ibotênico, os autores mostraram a importância dos neurônios intrínsecos das porções parvocelulares dorsal e medial do núcleo paraventricular hipotalâmico tanto na secreção diária de melatonina quanto na resposta fotoperiódica sazonal.

Dessa forma, o papel funcional do núcleo paraventricular no controle da produção diária de melatonina parecia estar resolvida, uma vez que trabalhos de lesão claramente demonstravam a total ausência de melatonina na falta desse núcleo. Ou seja, seu papel seria o de, quando ativo, promover, de alguma forma, o aumento da descarga simpática, ativação da NAT e produção de melatonina. De fato, Yanovsky et al (1987), demonstraram que a estimulação seletiva da região do núcleo paraventricular hipotalâmico, por tres horas consecutivas, no início do período de claro, provocava um aumento de 6-hidroximelatonina urinária, de modo a se atingir 50% da produção noturna. No mesmo sentido, sua estimulação, à noite, não alterava a quantidade de 6-hidroximelatonina produzida.

A literatura neuroanatômica é farta indicando as possíveis vias usadas pelo núcleo paraventricular hipotalâmico no controle da glândula pineal. Essa eferências se dão dorsal e lateralmente ao núcleo, incorporando-se ao fasciculo prosencefálico medial e projetando-se ipsilateralmente, de maneira direta ou indireta, sobre os neurônios pré-ganglionares simpáticos (Moller et al, 1991).

4.5. Relação funcional entre o núcleo supraquiasmático e o núcleo paraventricular hipotalâmico

A relação funcional entre o núcleo supraquiasmático e o núcleo paraventricular ficava evidenciada no trabalho de Lehman citado acima, que indicava ter, aquele núcleo, unicamente, o papel de temporizador de mais um sistema circadiano, no caso, distribuir ao longo das 24 horas a atividade do sistema funcional produtor de melatonina, de tal forma que sua produção se concentre durante a noite.

As características funcionais das conexões entre esses dois núcleos pode ser inferida a partir de dados conhecidos, que indicam serem os neurônios dos núcleos supraquiasmáticos mais ativos, tanto metabolicamente quanto eletricamente, durante o dia, do que durante a noite, qualquer que seja a espécie considerada. Dessa forma, pode-se associar, de forma invariável, não importando se em espécies de atividade diurna ou de atividade noturna, atividade neuronal no núcleo supraquiasmático e não produção de melatonina e, a ausência ou redução da atividade com produção de melatonina. Assim, se a ação do paraventricular hipotalâmico é a de promover a produção de melatonina, a conexão entre o supraquiasmático e ele, se direta, só pode ser inibitória. Recentemente, em trabalhos utilizando a técnica de microdiálise de estruturas cerebrais, demostrou-se que a conexão entre o núcleo supraquiasmático e o paraventricular hipotalâmico é inibitória e gabaérgica.

4.6 Papel das conexões neurais centrais diretas e folheto intergeniculado talâmico no controle da síntese de melatonina

Estudos eletrofisiológicos, neuroanatômicos e imuno-histoquímicos demonstram, de forma inequívoca, projeções centrais diretas sobre a glândula pineal, terminando, em sua maior parte, na região da lâmina intercalar ou pineal profunda. Estas projeções originam-se em diversos lugares entre os quais, o folheto intergeniculado talâmico, núcleo paraventricular hipotalâmico, hipotálamo lateral, região hipotalâmica tubero-mamilar e núcleo dorsal da rafe.

O possível papel funcional dessas conexões centrais diretas foi evidenciado por Cipolla-Neto e colaboradores (Bartol et al., 1997, Cipolla-Neto et al, 1995). Os autores estudaram os efeitos da lesão das regiões da pineal profunda (PP) (que elimina, portanto, todas as projeções centrais diretas sobre a glândula) e do folheto intergeniculado talâmico (IGL), tanto na ritmicidade diária do metabolismo da glândula pineal quanto na sua reatividade à foto-estimulação aguda noturna. Os resultados mostram que o IGL parece ser uma estrutura crítica no processo de inibição da síntese de melatonina quando da iluminação retiniana aguda noturna de 1 minuto de duração. Parte dessa inibição parece dever-se a suas projeções diretas sobre a glândula pineal, através da PP e parte dependente de suas projeções sobre estruturas hipotalâmicas. Por outro lado, o IGL não está envolvido no processo de foto-inibição induzido por estimulações luminosas mais prolongadas (15 minutos ou mais). Como, nesse caso, a região da pineal profunda também não está envolvida, conclui-se que a inibição da síntese de melatonina induzida por pulsos de luz de longa duração, provavelmente, dependente, do circuito clássico envolvendo o núcleo supraquiasmático, núcleo paraventricular hipotalâmico e simpático cervical.

Por outro lado, o folheto intergeniculado mostrou-se responsável pela modulação da amplitude da curva diária da produção de N-acetilserotonina, e provavelmente melatonina, pela glândula pineal e, diferentemente de sua ação sobre outros ritmos circadianos (p.ex. ritmo de atividade-repouso), o IGL não interfere no ângulo de fase do arrastamento entre o ritmo endógeno de produção de N-acetilserotonina (precursor imediato da melatonina) e o ciclo claro-escuro ambiental. Esse efeito modulador da amplitude não depende de suas projeções diretas sôbre a glândula pineal (uma vez que a lesão da PP não altera a amplitude diária do ritmo de NAS) e, portanto, provavelmente, depende de suas projeções sobre o circuito neural que classicamente mostra-se estar vinculado à produção diária de melatonina: retina, núcleo supraquiasmático, núcleo paraventricular hipotalâmico e simpático cervical. Dessa forma, o papel funcional das projeções diretas parecem restringir-se ao fenômeno inibitório agudo desencadeado por estimulação luminosa noturna de 1 minuto. Esse dado, importante, foi confirmado com a demonstração que a foto-estimulação noturna é capaz de inibir a produção residual de N-acetilserotonina na glândula pineal de animais ganglionectomizados (ablação do gânglio cervical superior, e portanto, de todas as conexões neurais com o simpático), sendo que essa inibição desaparece quando da lesão da região da pineal profunda.

4.7 Papel da região retroquiasmática hipotalâmica na síntese de melatonina

Os efeitos do folheto intergeniculado talâmico no controle da amplitude do ritmo diário de produção de melatonina e no controle do fenômeno de foto-inibição noturna induzido por pulsos de luz de longa duração, como vimos, depende da via de projeção genículo-hipotalâmica. Um dos alvos dessa projeção é a chamada área retroquiasmática. Essa região localiza-se imediatamente posterior aos núcleos supraquiasmáticos e anteriormente aos núcleos arqueados e eminência mediana. O papel mediador dessa região no controle da amplitude diária de melatonina e da foto-inibição noturna foi demonstrado por Cipolla-Neto e colaboradores (1999). Demonstrou-se que a área retroquiasmática pode ser dividida funcionalmente em duas regiões: região basal, responsável pela foto-inibição noturna da síntese de melatonina e a região lateral, responsável pelo controle da amplitude diária do ritmo de produção de melatonina.

4.8. Papel do núcleo dorsomedial hipotalâmico na síntese de melatonina

Dados de literatura mostram que os núcleos dorsomediais hipotalâmicos (DMH) recebem projeções maciças dos núcleos supraquiasmáticos e projetam-se, por sua vez, de forma importante para as porções parvocelulares dos núcleos paraventriculares hipotalâmicos. Dessa forma, em tese, eles poderiam participar do controle neural da produção circadiana de melatonina. Essa questão foi definitivamente esclarecida em trabalhos de Mota e colaboradores (2001), onde, através de lesão eletrolítica bilateral do DMH e avaliação das suas consequências sobre o metabolismo pineal e sobre o mecanismo de foto-inibição noturna da glândula, puderam concluir que o DMH não participa no controle do metabolismo pineal em ratos, seja no controle da amplitude e fase do ritmo diário de produção de melatonina, seja no fenômeno de foto-inibição noturna.

5. Metabolização da Melatonina

As duas principais vias de metabolização da melatonina ocorrem no fígado e no cérebro. No fígado ocorre a hidroxilação da melatonina formando 6-hidroximelatonina, seguida de uma conjugação com sulfato ou glucoronato, sendo posteriormente excretada na urina. No tecido cerebral, a melatonina é convertida em N-g -acetil-2-formilmetoxiquinurenamina que sofre degradação imediata à N-g -acetil-5-metoxiurenamina. Outras vias metabólicas menos importantes são a formação de N-acetilserotonina, e de 2-hidroximelatonina cíclica, ocorrendo em várias células.

6. Mecanismos de Ação da Melatonina

A melatonina é uma molécula anfipática e pode atravessar a membrana celular. Devido a esta propriedade a melatonina pode atuar não só sobre receptores de membrana, como modificar diretamente reações que ocorrem no interior das células. Os múltiplos mecanismos de ação possíveis tem tornado o estudo dos efeitos fisiológicos da melatonina um verdadeiro desafio. Assim sendo, a presença de receptores em membrana confere uma especificidade de ação para as células que os possuem, além de permitir que a resposta fisiológica ocorra em concentrações muito baixas, na faixa de picogramas por mililitro. Dois destes receptores já foram clonados, sendo aceitos como uma via importante de transdução da informação trazida pelo hormônio. Por outro lado, a atuação sobre reações bioquímicas apresentadas em diferentes células resulta em um efeito mais generalizado no organismo e necessita de concentrações maiores do hormônio. Como exemplo, podem ser citadas as ações antioxidante e inibitória da enzima calmodulina que são observadas em concentrações na faixa de miligrama por mililitro. Uma consideração importante é saber se estas altas concentrações podem ser obtidas no interior das células. Como a molécula de melatonina é anfipática esta poderia ser acumulada no interior da célula.

Os sítios de ligação para melatonina foram descritos a partir da ligação do análogo radioativo 2-[125I]-iodomelatonina e estão presentes em diversas regiões do sistema nervoso central, em artérias cerebrais e em diversos tecidos periféricos, como as adrenais, órgãos linfóides primários e secundários, coração, glândulas mamárias, trato gastro-intestinal, ducto deferente entre outros. Os trabalhos pioneiros na área foram feitos pelo grupo de Margarita Dubocovich, que também tem sido a responsável pelo Comitê de Nomenclatura destes receptores (Alexander and Peters, 1999). Os dados sobre receptores de melatonina estão consolidados em diferentes revisões (Dubocovich et al., 1999, Reppert 1997).

Inicialmente foram descritos dois sítios de ligação para melatonina, classificados em ML1 e ML2, de acordo com as diferenças farmacológicas da ligação à 2-[125I]-iodomelatonina. Os receptores do tipo ML1, encontrados em retina, núcleo supraquiasmático, artérias caudais, pars tuberalis entre outros, apresentam a seguinte relação de potência 2-I-iodomelatonina > melatonina >> N-acetilserotonina >> serotonina > prazosin. Os sítios de ligação do tipo ML2 possuem baixa afinidade (nM) para melatonina e alta afinidade para N-acetilserotonina, sendo bloqueáveis por prazosin (antagonista noradrenérgico). Os sítios de ligação do tipo ML1 foram clonados e pertencem à família de receptores acoplados à proteína G. Os sítios de ligação para ML2 ainda não foram clonados, o que dificulta a sua localização.

Os receptores ML1 agem principalmente inibindo a formação de AMPc sendo esta inibição sensível à toxina pertussis, sugerindo um receptor acoplado à proteína Gi/Go. Foram clonados três subtipos de receptores do tipo ML1 (Mel1a, Mel1b e Mel1c), sendo que os receptores do subtipo Mel1a estão presentes no núcleo supraquiasmático e na pars tuberalis podendo estar relacionados aos efeitos reprodutivos e circadianos da melatonina. Os receptores Mel1b estão envolvido no controle fotoperiódico de sensibilidade à luz na retina de mamíferos e aves. O subtipo Mel1c apenas foi descrito em anfíbios, sendo o cDNA deste receptor o primeiro a ser clonado. Este cDNA codifica uma proteína de 420 aa que contém 7 segmentos hidrofóbicos que representam as regiões transmembrânicas.

Recentemente, estes receptores receberam uma nova nomenclatura recomendada pela União Internacional de Farmacologia (IUPHAR). O primeiro receptor clonado Mel1b passa a ser chamado MT2, os receptores Mel1a passam a MT1 e os do subtipo ML2 passam a ser denominados MT3. A nomenclatura segue as normas da IUPHAR que recomenda que receptores clonados, cuja função e localização biológica ainda não foram obtidas sejam escrito em letras minúsculas, receptores clonados e com função definida sejam escritos em letras maiúsculas (MT1, MT2) e receptores que tenham sido verificados por métodos funcionais, mas que não tenham sido clonados, são escritos em letras maiúsculas mas em itálico (MT3). Essa nova classificação foi feita apenas para receptores encontrados em mamíferos e portanto a nomenclatura não abrange o subtipo Mel1c que só foi encontrado em anfíbios e aves (Tabela 1). É importante que se conheçam as duas nomenclaturas, já que ambas são encontradas na literatura.

Na busca de agonistas mais seletivos para os subtipos de receptores estão sendo testados novos análogos da molécula de melatonina. O análogo 5-metoxicarbonilamino-N-acetil-triptamina (5-MCA-NAT) se liga seletivamente a sítios MT3 em rins, testículos e cérebro de hamster mas não é capaz de ligar a sítios MT1 em retina de aves. O análogo 4-phenil 2-propionamidotretalina (4-P-PDOT) atua seletivamente como antagonista de receptores do tipo MT2, no entanto, em alguns modelos experimentais ("rolling" de leucócitos sobre endotélio) este ligante pode atuar como agonista (Lotufo et alli, 2001).

Os receptores para melatonina clonados até o momento (MT1 e MT2) são receptores acoplados à proteína G, sensíveis à toxina pertussis, que promovem redução dos níveis de AMP cíclico por inibir a enzima adenilil ciclase. No entanto, considerando que nos últimos anos tem sido demonstrado que subunidades b g acopladas de proteínas Gi podem ativar fosfolipase C levando à liberação de cálcio do retículo; apesar de ainda não demonstrado, este mecanismo, ao menos teoricamente, também pode contribuir para a resposta dos receptores de melatonina dos subtipos MT1 e MT2.

O sítio de ligação MT3 foi caracterizado recentemente, e tem localização intracelular, sendo uma isoforma da enzima quinona redutase 2 (Nosjean et alli, 2000). Sua distribuição é bastante generalizada, mas apresenta particularidades para determinadas espécies (Nosjean et alli, 2001).

Tabela 1 - Classificação dos Receptores de Melatonina segundo a União Internacional de Farmacologia (IUPHAR).

Classificação

Caracterização

IUPHAR

Antiga

estrutura

sinal de transdução

afinidade à ligantes

ligantes seletivos

MT1

Mel1A (ML1)

clonado acoplado Gi

?AMPc sensível à PTX

2-iodo melatonina ³ 6-cloromelatonina >melatonina > 6-metoximelatonina >N-acetilserotonina >5-metoxitriptamina >>serotonina

 

MT2

Mel1B

clonado acoplado Gi

?AMPc sensível à PTX

2-iodo melatonina ³ 6-cloromelatonina >melatonina > 6-metoximelatonina >N-acetilserotonina >5-metoxitriptamina >>serotonina

4P-PDOT

a

Mel1c

clonado acoplado Gi

?AMPc sensível à PTX

2-iodo melatonina ³ 6-cloromelatonina >melatonina > 6-metoximelatonina >N-acetilserotonina >5-metoxitriptamina >>serotonina

 

MT3

ML2

atividade semelhante à da quinona

semelhante à enzima redutaseb

N-acetilserotonina > melatonina >prazosin MCA-NAT agonista seletivo

MCA-NAT

aA IUPHAR classifica apenas receptores de mamíferos, Mel1c é receptor de anfíbio

b notar que esta ação foi observada em tecidos específicos e pode não corresponder a todas as funções que seguem a relação de potência descrita para MT3.

PTX à toxina pertussis, MCA-NAT à 5- metoxicarbonilamino-N-acetiltriptamina

7. Variação Rítmica dos Receptores de Melatonina

Além do ritmo circadiano de síntese de melatonina, a densidade de receptores também apresenta ritmo. Trabalhos realizados pelo grupo de Pévet tem mostrado que no núcleo supraquiasmático e na pars tuberalis da hipófise, a densidade de proteína e de RNA mensageiro para receptores de melatonina apresenta uma variação com o ciclo claro/escuro ambiental (Gauer et alli, 1993, Guerrero et al., 2000). No caso da pars tuberalis foi evidente que este ritmo é devido a uma ação da melatonina sobre o próprio sistema receptor. A melatonina leva a uma diminuição da proteína receptora e a um aumento do RNA mensageiro correspondente (Guerrero et al., 2000). Já no núcleo supraquiasmático, apesar de não ser negada uma dessensibilização do receptor pelo próprio agonista, foi verificado que em animais pinealectomizados a ausência de luz pode levar a uma redução dos receptores para melatonina e que a densidade era revertida após 1 hora de luz. O efeito da luz foi bloqueado pelo tratamento com inibidores de receptor NMDA (Gauer et al., 1994). Nem todos os animais apresentam este tipo de variação, como por exemplo o cérebro de salmão, que mantém constante o número de receptores ao longo do dia.

8. Ações Intracelulares da Melatonina

Na década de 1990, o grupo de R. Reiter no Texas, iniciou estudos que têm demonstrado ser a melatonina capaz de atuar como antioxidante. Em revisão da literatura dos últimos 12 anos, Cuzzocrea e Reiter (2001), apontam que a melatonina e moléculas afins têm propriedades de "scavanger", podendo reduzir a concentração de radicais livres em sistemas biológicos e químicos. Nesta oportunidade também são revistos trabalhos que indicam que além de uma ação antioxidante direta, a melatonina é capaz de agir sinergicamente com outros antioxidantes conhecidos, tais como, vitamina E e ácido ascórbico. A necessidade de altas concentrações intracelulares , muitas vezes superior às chamadas "concentrações fisiológicas", têm gerado grande controvérsia na área. Apesar de ainda não termos um conhecimento consolidado sobre o assunto, o fato da melatonina poder ser sintetizada localmente, e portanto, atingir concentrações superiores ao plasma, deve ser considerado.

9. Efeitos da Melatonina

Na década de 1950 a ação fisiológica da glândula pineal estava ligada à reprodução (Reiter 1980). Numerosas publicações sugeriam que a melatonina tinha ação pró-gonadotrófica, enquanto outras, não menos relevantes em número, apontavam a ação do hormônio da pineal como anti-gonadotrófico. Nos anos 60, a soma de conhecimentos da área da cronobiologia com conhecimentos da bioquímica da pineal permitiram resolver esta discrepância, demonstrando que a melatonina é um transdutor fotobiológico, sendo capaz de traduzir para termos biológicos as variações dos fotoperíodos ambientais. Assim sendo, em animais que têm longo período de gestação (ex. ovinos), a melatonina é um hormônio pró-gonadotrófico, enquanto em animais com curtos períodos de gestação (hamster) a melatonina é antigonadotrófica.

Atualmente sabemos que a melatonina é um hormônio que possui diferentes funções; atuando como um agente endócrino ou parácrino (Stefulj et alli, 2001). Como função mais abrangente a melatonina ajusta a resposta do organismo às condições de escuro, permitindo que haja uma adaptação às atividades e desempenhos noturnos de cada animal. Na maioria dos órgãos e tecidos a chegada da melatonina ocorre pela via circulatória e, portanto reflete a atividade da glândula pineal. Na retina a melatonina é produzida de forma rítmica localmente, e também tem como função adaptar os animais ao escuro. Esta é uma função parácrina. No final do capítulo são recomendadas algumas revisões que permitirão um aprofundamento no assunto, mas lembramos que este é um assunto em franca evolução e novos dados são constantemente somados à literatura.

9.1. Melatonina e adaptação à luz na retina

A percepção visual implica em mecanismos de adaptação a diferenças na iluminação ambiental. A melatonina e a dopamina produzidas localmente exercem funções opostas, ou seja, a melatonina favorece a via dos bastonetes e a dopamina a dos cones, permitindo que a visão seja adaptada à quantidade de luz que atinge a retina. A melatonina é sintetizada apenas no escuro e inibe a liberação de dopamina, além de poder ter uma ação direta sobre o alongamento dos segmentos externos dos cones e uma diminuição dos segmentos externos dos bastonetes.

9.2. Melatonina e Reprodução

Está bem estabelecido que a melatonina tem influência sobre a sincronização da resposta reprodutora apropriada de vários animais às condições ambientais. Como descrito anteriormente a melatonina pode agir de forma pró-gonadotrófica, ou antigonadotrófica na dependência da espécie animal. Foram caracterizados sítios de ligação para melatonina nas gônadas, no epidídimo, no ducto deferente e na glândula mamária, sugerindo vários locais de ação. O papel da melatonina no desenvolvimento sexual e na reprodução humana ainda estão sendo investigados. Em mulheres, foi demonstrado que as concentrações de melatonina e de progesterona variam com as estações do ano, e que há uma correlação negativa entre melatonina e a produção de estrógeno. A melatonina em humanos possui importante ação antigonadotrófica, visto que inibe a produção de hormônio liberador do hormônio de crescimento (GnRH), que é essencial para o desenvolvimento das gônadas na fase de puberdade (Vanecek, 1998).

Há na literatura uma certa controvérsia quanto a variação estral do pico noturno de melatonina. Recentemente, utilizando a técnica de microdiálise da pineal para a dosagem de indóis e medindo a expressão gênica das principais enzimas, foi demonstrado por alguns de nós (Skorupa, et al., em publicação), usando a técnica da microdiálise pineal para dosagem continuada dos indóis, além de um estudo sistemático da atividade e expressão gênica das principais enzimas pineais, de forma definitiva que, em ratos, não há variação estral do metabolismo pineal.

Além da função endócrina, a melatonina também exerce uma função parácrina sobre o sistema reprodutor, visto que sua síntese já foi demostrada no trato reprodutor de ratos (Borjigin et alli, 1995, Huether et alli, 1992, Tijemes et al.., 1997 Itoh et alli, 1997) e em ovário humano (Itoh et alli, 1997).

9.3 Melatonina e Controle Circadiano

O ritmo plasmático de melatonina tem sido considerado um excelente marcador de fase do relógio biológico endógeno por vários grupos de pesquisadores. Segundo a pesquisadora escocesa, Josephine Arendt, este seria melhor que apenas a medida do ritmo de temperatura, que é mascarado pela atividade física, ou a medida isolada do ritmo de cortisol, que é afetado pelo estresse e alimentação. O maior fator de mascaramento do sinal de melatonina é a luz, visto que esta inibe de imediato sua produção. O ritmo plasmático de melatonina varia entre diferentes indivíduos, mas é extremamente constante quando medido no mesmo sujeito em diferentes dias. Os principais metabólitos urinários da melatonina, a 6–sulfatoximelatonina e 6-hidroximelatonina, vêm sendo bastante usados em estudos cronobiológicos, devido ao fato de poderem ser medidos de forma não invasiva.

A melatonina administrada a humanos, em doses fisiológicas e farmacológicas, pode induzir mudança de fase de ritmos circadianos. O mecanismo pelo qual a melatonina atua sobre os sistemas de temporização ainda é objeto de estudo, mas a presença de receptores de melatonina (MT1 e MT2) nos núcleos supraquiasmáticos tem sido demonstrada em diferentes espécies de animais.

A melatonina provavelmente interfere diretamente na queda de temperatura observada em humanos à noite. O nadir da temperatura corporal ocorre cerca de 1 hora após o pico de concentração de melatonina. Esta relação poder ser apenas casual, no entanto, é preciso ressaltar que a administração aguda de melatonina (0,5 – 5 mg) leva a uma diminuição aguda da temperatura corporal. Esta redução da temperatura corporal é dependente da dose de melatonina e é acompanhada por uma diminuição do alerta (Harris et alli, 2001). Apesar dos dados serem bastante relevantes, ainda há necessidade de mais experimentos na área para que esta interessante hipótese seja comprovada.

De grande importância na interação entre diferentes espécies é a possibilidade da melatonina sincronizá-las ao ciclo claro/escuro ambiental, e desta forma otimizar a interação entre as mesmas (Hotta et alli, 2000, Garcia et al., 2001). Desde o início do século passado já havia sido observado um padrão temporal sugestivo de ritmicidade circadiana nas variações de temperatura de indivíduos com malária. Hawking foi um dos primeiros a demonstrar que este fato não era exclusivo para os Plasmodiuns que afetavam o homem (P. falciparum, P. vivax), mas também para os que afetavam outras espécies de vertebrados. Em 1929, Boyd já havia demonstrado que em aves, a inversão do ciclo claro/escuro ao qual o hospedeiro estava submetido resultava em inversão do ciclo do parasita. Em 1969 Arnold demonstrou que a pinealectomia de camundongos resultava em uma dessincronização das formas eritrocitárias do P. berghei. Recentemente, em colaboração com a Profa. Célia R. Garcia da Univerisdade de São Paulo, ficou demonstrado que a melatonina é o hormônio que sincroniza o rompimento de hemáceas em camundongos, sendo portanto essencial para a sincronização do ciclo de vida do parasita da malária. Além disso, ficou demonstrado que a melatonina pode sincronizar a esquizogonia também "in vitro" . A sincronização da esquizogonia "in vitro" e "in vivo" foi bloqueada por luzindole, um antagonista competitivo de receptores para melatonina. Nosso grupo também demonstrou que a melatonina atua aumentando a concentração intracelular de cálcio no parasita, induzido pela estimulação de receptores de melatonina localizados no parasita e acoplados à fosfolipase C (Hotta et alli, 2000).

9.4. Melatonina e as Respostas de Defesa do Organismo (Resposta Imunológica e Resposta Inflamatória)

A primeira relação entre a glândula pineal e o sistema imunológico foi descrita em 1965, mostrando uma desorganização do timo após pinealectomia em ratos neonatos (Csaba et al., 1965). Atualmente, podemos encontrar uma vasta bibliografia sobre o efeito da melatonina nas respostas de defesa do organismo. Parte destas respostas resulta de uma ação endócrina em resposta à melatonina liberada ritmicamente pela glândula pineal. Os efeitos endócrinos devem ser abolidos por inibição da produção de melatonina pela pineal ou por ablação desta glândula. Por outro lado, dados de diferentes laboratório têm demonstrado que células imuno-competentes são capazes de sintetizar melatonina localmente (para revisão Kvetnoy, 1999) o que resulta em uma ação parácrina, independente do rítmo diário. Na realidade vários tecidos e células são capazes de acumular melatonina, mas apenas aqueles que expressam RNA mensageiro para a N-acetiltransferase e a hidroxi-O-metiltransferase têm a capacidade de sintetizar este hormônio (Stefulj et al., 2001). O fato de haver uma produção parácrina resulta em concentrações locais superiores às observadas no plasma, independentes da ritmicidade da pineal (Abuja et al., 1997, Wölfler et al.., 1999). No caso de células da medula óssea de humanos e camundongos, a concentração de melatonina atinge a faixa de ng/mg de tecido (Conti et alli, 2000).

As células imuno-competentes possuem receptores de membrana para melatonina acoplados à proteína G (Poon et alli, 1994, Maestroni 1995) e este hormônio, por ter um alto coeficiente de partição óleo-água pode também atuar no meio intracelular. Os sítios de ligação para melatonina são mais abundantes em células CD4+ do que CD8+, sugerindo que os linfócitos CD4+ são as células mais responsivas à melatonina na subpopulação linfocitária. Nessas células a melatonina estimula a produção de interleucina-2 (IL-2) e interferon g (IFNg ). Por outro lado, a administração de IL-2 inibe a produção de melatonina pela glândula pineal, indicando um sistema de retroalimentação negativo (revisto por Maestroni, 1998). É importante ressaltar que a susceptibilidade à melatonina varia com a hora do dia e a estação do ano. Em camundongos, foi mostrado que a melatonina aumenta a citotoxicidade celular dependente de anticorpo apenas quando administrada durante o verão.

Em vários modelos experimentais de choques séptico e não séptico, a melatonina tem efeito protetor, diminuindo a taxa de mortalidade. Este efeito protetor, bem como uma possível ação de retardo do envelhecimento, proteção contra a toxicidade de drogas antitumorais, de estresse oxidativo no sistema nervoso central, lesões geradas por reperfusão após isquemia e proteção contra úlcera gástrica, são atribuídos à ação antioxidante deste hormônio (Cuzzocrea e Reiter, 2001). A base molecular para atribuir uma ação antioxidante à melatonina baseia-se na sua capacidade de atuar como um doador de elétrons em processos não enzimáticos, além de inibir enzimas da família citocromo P450. De uma forma geral sugere-se que a melatonina reduza a formação de peroxinitritos em modelos de inflamação e pleurisia, peroxidação lipídica e a expressão da sintase de óxido nítrico. O efeito antioxidante da melatonina é obtido apenas com doses farmacológicas, isto é, doses superiores às concentrações encontradas no plasma. No entanto, precisamos considerar que a melatonina pode ser liberada em locais de ação específicos em altas concentrações devido à ação parácrina. O processo inflamatório inicia-se com alterações na microcirculação que resultam em edema decorrente de vasodilatação arteriolar, aumento de permeabilidade vascular e migração de leucócitos. O aumento da permeabilidade vascular causa diminuição na velocidade sangüínea permitindo que os leucócitos que trafegam normalmente pela região central do vaso entrem em contato com o endotélio, num processo denominado marginalização leucocitária. A interação dos leucócitos com o endotélio inicia a migração celular dividida em três etapas: "rolling", adesão e transmigração, como pode ser visto na Figura 4. A inflamação aguda é caracterizada pela migração de grande quantidade de neutrófilos. Quando o agente agressor não pode ser eliminado pela resposta aguda esta pode ser cronificada. Neste caso as principais células envolvidas são os macrófagos, linfócitos e, em alguns casos, eosinófilos.

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Figura 4 – Ilustração das etapas que levam à migração de leucócitos dos vasos para os tecidos. Inicialmente os leucócitos marginalizam, entrando em contato com as células endoteliais. Estas células rolam sobre a parede dos vasos, para em seguida aderirem ao endotélio e transmigrarem da luz dos vasos para os tecidos. Cada uma destas etapas é atingida por estímulos diferentes e mediadas por diferentes moléculas de adesão. (desenhado por Lotufo, CMC)

Recentemente, utilizando a técnica de microscopia intravital em fascia espermática de ratos, foi verificado em nosso laboratório, que doses fisiológicas de melatonina inibem os processos de "rolling" (IC50 = 2,7 pM) e adesão (IC50= 1,4 nM) de neutrófilos às células endoteliais (Lotufo et alli, 2001). Além disso, a adesão, mas não o "rolling", foi inibida por N-acetilserotonina, precursor direto da melatonina e que é encontrada em concentrações da ordem nM no plasma. A potência da N-acetilserotonina em inibir a adesão foi maior que a da melatonina. Tanto o efeito da melatonina em "rolling" e adesão, quanto o da N-acetilserotonina sobre a adesão foram inibidos por luzindole, indicando que a melatonina está atuando através de receptores de membrana, como vemos na Figura 5. Estes dados corroboram os achados anteriores mostrando que na resposta aguda o número de leucócitos que migra para o foco inflamatório apresenta um ritmo circadiano.

 

Figura 5 – Melatonina e análogos inibem o "rolling" (A) e a adesão de leucócitos (B) induzida por leucotrieno B4. Luzindol bloqueia o efeito inibitório da melatonina e análogos sobre o rolling (C) e o efeito da melatonina e de seu precursor N-acetilserotonina (NAS) sobre a adesão de leucócitos (D). Dados obtidos através de microscopia intravital da fáscia espermática de ratos (adaptado de Lotufo et al., 2001).

Após a migração e ativação dos neutrófilos, estes passam a produzir as enzimas sintase do óxido nitrico induzida (iNOS) e ciclooxigenase induzida (COX2), que são muito importantes na resposta inflamatória. A melatonina é capaz de reduzir a síntese destas enzimas e de seus produtos em diferentes modelos experimentais (Cuzzocrea e Reiter, 2001). O efeito inibidor da melatonina está diretamente relacionado à sua capacidade de bloquear a ativação do fator nuclear kappa B (NFkB), que é a via comum na indução de iNOS e COX2 em processos inflamatórios (Moham et al., 1995).

A melatonina também atua na fase crônica do processo inflamatório. A lesão crônica da pata induzida por BCG ou nistatina apresenta um ritmo circadiano. O volume da pata inflamada e a permeabilidade vascular são maiores na fase de claro do que na fase de escuro. Esta ritmicidade não é observada em camundongos pinealectomizados e é restaurada por ingestão de melatonina, adicionada à água, oferecida apenas na fase de escuro. Nestes experimentos foram testadas apenas doses farmacológicas (Lopes et al., 1997, 2001).

Por outro lado, em inflamação alérgica pulmonar, asma brônquica, a melatonina apresenta efeito pró-inflamatório (Tavares de Lima et al, J. Pineal Res., 2001). Nesse modelo o infiltrado de eosinófilos no pulmão e a proliferação de céluas na medula estão reduzidos em animais pinealectomizados e se intensificam com a reposição de melatonina.

Em resumo, os dados disponíveis deixam evidente que a melatonina atua como modulador de respostas inflamatórias e de respostas imunológicas. Esta modulação parece ser positiva ou negativa, na dependência das células e mediadores envolvidos no processo. Além disso, estes efeitos podem ocorrer em concentrações compatíveis com o pico noturno de melatonina, ou em concentrações muito maiores, que sabidamente podem ser alcançadas quando melatonina é administrada como fármaco, mas ainda resta dúvida se essa ação pode ter alguma relevância fisiopatológica.

9.5. Melatonina – fator secundário em diferentes fisiopatologias

Diferentes fisiopatologias promovem alterações importantes na produção de melatonina. Neste item serão descritas apenas algumas, mas a lista vem sendo acrescida constantemente de novas informações.

Em epilepsia humana é observado um ritmo diário nos fenômenos de convulsão, o que sugere o envolvimento de sinais temporais endógenos dependentes do relógio biológico. Apesar da melatonina exógena, quando administrada em doses farmacológicas poder levar a uma diminuição dos quadros convulsivos, provavelmente devido ao seu efeito anti-oxidante, um aumento do número de convulsões é observado quando do aumento noturno de melatonina endógena. Uma possível explicação para esta discrepância é que a melatonina inibe a liberação de dopamina, que é um neurotransmissor envolvido no controle de convulsões epilépticas (Stewart, 2001).

Pacientes com Alzheimer apresentam concentrações diurnas de melatonina superiores a de idosos normais e a resposta a pulsos de luz está muito reduzida (Ohashi et alli., 1999) Em pacientes com Alzeheimer os receptores MT1 no hipocampo, responsáveis pelo controle da tensão vascular, tem seu número significativamente aumentado em relação a sujeitos normais da mesma idade (Savaskan et al.., 2001, provavelmente devido a uma "up regulation" em resposta à dimunição da melatonina circulante O pico noturno de melatonina não ocorre, ou é muito reduzido em idosos normais. A melatonina apresenta uma redução na formação da proteína b amilóide, tendo portanto um efeito que permitiria supor uma ação anti-Alzheimer (Pappola et alli, 2000, Lahiri et alli, 1999). A melatonina também tem um efeito sobre a retenção de memória, tendo sido efetiva na reversão da perda de memória em animais velhos e em modelos de Alzheimer (ratos intoxicados cronicamente com etanol, ou submetidos a administração aguda de azidium) ( Raghavendra e Kulkarmi, 2001). No entanto, como observado em outras situações a melatonina pode ter um efeito duplo em modelos experimentais. A melatonina 0,1 mM é capaz de bloquear alteraçãoes causadas por peptídeo b amilóide em fatias organotípicas de cérebro de rato, enquanto um aumento de 10 vezes na concentração (1 mM) resulta em um quadro de estresse oxidativo (Clapp-Lilly et al., 2001).

Demonstrou-se recentemente que a cefaléia crônica diária está associada a uma alteração considerável do ritmo diário de melatonina além de outras alterações hormonais importantes (Peres et al., 2001).

Do ponto de vista experimental foi demonstrado um papel importante da melatonina na regulação do metabolismo de carboidratos (Lima et al.1998, Serefim et al.,1997; Picinato, 2001). Assim, demonstra-se que animais pinealectomizados desenvolvem uma síndrome de resistência insulínica (em adipócitos e células musculares) dependente de uma redução considerável na síntese dos transportadores de glicose do tipo GLUT4. Além disso, tanto in vivo quanto in vitro há uma alteração substancial do ritmo de produção e secreção de insulina pelas células B pancreáticas. Em suporte a essa alteração funcional demonstrada para a secreção de insulina pelo pâncreas, de Lima et al. (2001) demonstraram consideráveis modificações morfológicas e morfométricas das células B em animais pinealectomizados.

10. Perspectivas clínicas

As propostas de utilização clínica da melatonina estão relacionadas com dois grandes alvos, controle e tratamento de afecções ligadas ao ritmo circadiano e ações protetoras ligadas ao possível efeito anti-oxidante. A primeira abordagem tem sido feita em estudos de controle de distúrbios de sono e distúrbios decorrentes de desajuste do relógio endógeno em relação ao ciclo geofísico. Esta última situação ocorre em viagens aéreas transmeridianas e em indivíduos que trabalham em horários irregulares.

10.1. Distúrbio do Ritmo Circadiano

Sob a denominação de distúrbio do ritmo circadiano podemos encontrar várias expressões patológicas que interferem com a vida de milhares de pessoas. Entre estas podemos citar: "jet lag", cegueira, insônia, alguns distúrbios da idade, alguns distúrbios psquiátricos e condições onde o "zeitgeiber" natural, o ciclo de iluminação, apresenta um sinal muito fraco (inverno com noites longas), turnos alternantes de trabalho. Distúrbios de ritmos circadianos podem acompanhar outras afecções em que aparecem como efeitos secundários. Vários estudos têm demonstrado que nestas condições pode-se ter uma reposição do hormônio, ou um ajuste da hora de aparecimento do pico do mesmo, de forma a permitir um ressincronização da funções do organismo. Nesse sentido, em revisão recente, a pesquisadora Josephine Arendt (Arendt, 1999), importante especialista no tema, considera que a função primária da melatonina nos mamíferos é prover informação sobre a duração da noite e o transcorrer do ano. Nas espécies com forte impacto fotoperiódico estas são informações essenciais para assegurar que as funções dependentes das estações do ano sejam ajustadas corretamente. Desta forma a melatonina tem um papel essencial nas funções reprodutoras, naquelas ligadas à pelagem e muito provavelmente, no controle do sono. Os estudos que vem sendo realizados indicam que a melatonina seria não apenas um coadjuvante na organização circadiana, mas teria importante função na informação sobre o escuro. A melatonina tem sido considerada como um hormônio que sinaliza para as diversas partes do organismo a ocorrência da noite no ambiente. No caso de humanos isso inclui o sono e a diminuição da temperatura corporal. Assim a melatonina atuaria em conjunto, porém internamento, com o ciclo claro/escuro para manter a sincronia com o dia solar.

10.2. Sono

Os dados com humanos, apesar de variáveis, indicam que a melatonina é um fármaco capaz de influenciar o sono (Arendt, 2000). Um dos pontos mais evidentes é que a melatonina (0,1 – 10 mg) é capaz de reduzir a temperatura corporal, alterar a Curva de Resposta Dependente de Fase à luz e diminuir a latência para o início do sono (Gilbert et alli, 1999). Um outro experimento relevante foi a demonstração de que a supressão de melatonina noturna em sujeitos mantidos em privação de sono diminui a sonolência. Estes dois fatos analisados em conjunto sugerem que a melatonina levaria ao sono e a sua retirada diminuiria a sonolência. A observação de que a redução da temperatura corporal é um dos fatores que precede o sono (Krauchi e Wirz-Justice, 2001) e que a melatonina leva a esta redução é relevante porque receptores de melatonina foram detectados em arteríolas da base do encéfalo responsáveis pela perda de calor (Capsoni et alli 1994; Viswanathan et alli, 1997).

A associação de benzodiazepínicos e melatonina reduziu a latência para o início do sono em pacientes idosos, comparados com pacientes tratados apenas com benzodiazepínicos. A melatonina também aumentou a eficiência do sono e reduziu o aparecimento de efeito rebote em protocolos de retirada de benzodiazepínicos (Zisapel, 1999).

Nos indivíduos idosos, onde a piora do sono está ligada à diminuição da produção de melatonina, protocolos que restauram o pico noturno de melatonina através da administração desse hormônio (0,3 mg/ dia) promovem uma melhora significativa do quadro. Em idosos não insones, a melatonina não interfere no sono, mesmo que estes apresentem um pico de melatonina menor que indivíduos adultos normais (Wurtman, 2000).

Vários relatos na literatura demonstram que a melatonina pode modular positivamente o sono, mas a utilização de melatonina como um hipnótico ainda traz algumas controvérsias. Um outro fato importante é que ainda existe uma disputa entre os pesquisadores quanto à dose de melatonina a ser aplicada em caso de insônia, podendo variar de 0,1 a 3 mg. A afirmação do pesquisador do MIT R. Wurtman de que a menor dose efetiva deve ser usada, para evitar dessensibilização dos receptores é bastante apropriada (Wurtman, 2000).

10.3. "Jet lag" (dessincronização após vôos transmeridianos)

O "Jet lag" é um fenômeno que ocorre em pessoas que atravessam meridianos num mesmo dia, e por isso têm que se adaptar a um novo fuso horário. Esta adaptação traz vários sintomas como por exemplo: cansaço, diminuição da qualidade de sono, aumento do tempo de latência do sono, e diminuição do tempo total de sono. Vários testes clínicos foram realizados com voluntários após vôos intercontinentais, verificando-se que a administração de melatonina administrada antes de deitar, tanto em doses fisiológicas (0,5 mg), como em doses farmacológicas (5,0 mg), foi capaz de diminuir todos os sintomas do jet lag. Ressalte-se que em doses farmacológicas (5,0 mg), as propriedades de aumentar a qualidade de sono e diminuir a latência são mais efetivas.

10.4. Depressão sazonal

A depressão sazonal é um distúrbio do ritmo circadiano causado pela dessincronização entre o relógio solar e o relógio biológico humano durante as estações de fotoperíodos curtos (Arendt, 1999). Nestas estações a produção de melatonina pela glândula pineal durante a fase de escuro aumenta sua duração. A este aumento é atribuída a depressão sazonal. Com a exposição à luz no período da manhã, inibe-se a produção de melatonina e reverte-se o quadro de depressão (Cardinali, 2000).

10.5. Envelhecimento

O aumento da idade da população na maioria dos países é seguida por um aumento significativo da morbidade devido às principais doenças associadas ao envelhecimento – doença cardiovascular, câncer, doença neurodegenerativa, diminuição da resistência a infecções, diabetes mellitus. Pelo fato da produção de melatonina diminuir com a idade (Reiter, 1995, Touitou et al., 1997), alguns estudos foram realizados utilizando as propriedades antioxidantes da melatonina como droga na prevenção do envelhecimento, levando em consideração a teoria moderna do envelhecimento por radicais livres, ou seja, perda do balanço dos antioxidantes/prooxidantes causando o estresse oxidativo, desregulação da função celular e envelhecimento. Vários trabalhos podem ser encontrados na literatura relatando um aumento da duração de vida de camundongos que recebem melatonina por longos períodos. No entanto, paralelamente ao aumento da duração da vida, ocorre um aumento da incidência de câncer (Anisimov et alli, 2001). Uma discussão atualizada do efeito da melatonina e de outros possíveis geroprotetores é encontrada na revisão de Anisimov (2001).

10.6. Câncer

Os efeitos da melatonina sobre o desenvolvimento e tratamento de câncer foram investigados e há relatos na literatura mostrando que este hormônio tem ação antiproliferativa e imunoestimulante, quando utilizado em doses farmacológicas (acima de nM). Porém esta ação não é universal, sendo caracterizada principalmente em tumor de mama humano responsivo a estrógeno. Por outro lado, a melatonina tem sido testada como coadjuvante em tratamento quimioterápico associada com IL-2. Esta associação diminuiu a toxicidade de IL-2, atribuída à capacidade antioxidante da melatonina, bem como diminuiu a dose de IL-2 no tratamento, pois foi demonstrado que este hormônio induz a expressão do receptor de IL-2, aumentando a sensibilidade das células (Maestroni, 2001).

10.7. Medicina Legal

A melatonina, por sua síntese rítmica, possui concentrações variáveis ao longo do dia em humanos. A concentração do hormônio e a atividade das enzimas de síntese N-acetilserotonina e hidroxi-indol melatonina medidas após a morte está diretamente correlacionada com o horário da morte (Smith et alli, 1977).A dosagem deste hormônio em vítimas de acidentes fatais, permite aos investigadores forenses utilizarem a relação entre a concentração de melatonina e a hora do dia em que a morte ocorreu. As análises mais precisas foram obtidas da quantidade de melatonina na glândula pineal, enquanto que as menos precisas foram obtidas da dosagem de melatonina no sangue ou na urina (Mikami et al.., 1994).

11. Conclusões

A melatonina tem uma atuação importante como hormônio do escuro, mas também pode, em doses superiores atuar independente da hora do dia. Importante ressaltar que as ações da melatonina podem ocorrer via diferentes sistemas de recepção, tais como receptores de membrana e processos bioquímicos intracelulares. O próprio sistema de recepção pode variar ao longo do dia, conferindo uma outra forma de modulação das funções fisiológicas não analisada neste capítulo.

Além da melatonina, o seu precursor N-acetilserotonina atua diretamente em diferentes modelos experimentais, além de ter afinidade maior que a melatonina pelos receptores MT3 e serem agentes antioxidantes mais potentes de que a própria melatonina. A N-acetilserotonina é liberada pela glândula pineal em concentrações maiores que a própria melatonina. Apenas recentemente o estudo da N-acetilserotonina vem sendo feito com o enfoque cronobiológico e mais dados serão necessários para que possa ser afirmado que parte da interferência da pineal sobre a ritmicidade do organismo ocorre através do precursor da melatonina.

 

Discutimos neste capítulo a importância da melatonina na regulação de fenômenos rítmicos diários e sazonais. Discutimos como que, através de uma inervação simpática, os co-transmissores noradrenalina e ATP promovem a síntese de melatonina e quais os circuitos neurais envolvidos nesse controle. Vimos a importância fundamental dos núcleos supraquiasmático e paraventricular hipotalâmicos, assim como a importância de outras estruturas e vias neurais como o folheto intergeniculado talâmico, a via direta de projeção central e a área retroquiasmática. Foram descritos os mecanismos de ação da melatonina, através de receptores de membrana e efeitos intracelulares. Foi feita uma revisão sobre a participação deste hormônio em processos fisiopatológicos, distiunguindo ações endócrinas e parácrinas. Finalmente, abordamos sucintamente aplicações deste hormônio como arma terapêutica.